Einleitung

Der Nachweis von Pathogenen in Nahrungsmitteln ist ein wichtiger Anwendungsbereich der klassischen Mikrobiologie. Die PCR kann hier - wie in vielen anderen Disziplinen - Fortschritte und Verbesserungen einbringen. Seit einigen Jahren hat sich die Real Time PCR (RT-PCR, qPCR) auch in der Lebensmittelanalytik etabliert. Als geschlossenes System ist die Methode in der Durchführung einfach, schnell, sicher und günstig.

Bei richtiger Durchführung zeigt sie gegenüber anderen Verfahren eine hohe Sensitivität, geringe Anfälligkeit für Kontaminationen (falsch positive Ergebnisse) und durch die Möglichkeiten der Multiplex-Technik einen weitaus höheren Durchsatz. Zu diesen Vorteilen kommt darüberhinaus die Möglichkeit der schnellen und einfachen Quantifizierung, die es erlaubt, zu überprüfen, ob gegebene Grenzwerte eingehalten werden. PCR- oder qPCR-Methoden setzen meist nach der Anreicherungskultur an und ermöglichen eine Zeitersparnis von 3 bis 4 Tagen.  

Themen des Theorie-Seminars

§ Prinzip der Real Time PCR

§ Grundlagen der Real Time PCR: Detektionsformate, Ct-Werte, Threshold, Baseline, Farbstoffe und Kanäle etc.

§ Real Time PCR Zielsequenzen: Sequenzen, Primer und Sonden

§ LFGB-Methoden zum Nachweis von Pathogenen, zur Identifizierung von Arten und zum Nachweis und GVO

§ Lebend/tot-Nachweis über Real Time PCR

§ Besprechung von Nachweis, Screening- und Quantifizierungs-Kits

§ Diskussion an Beispielen von Nachweisgrenze und Quantifizierungsgrenze (LoD, LoQ)

Themen der Praxis-Schulung

§ Präparation von genomischer DNA aus Anreicherungskultur

§ Nachweis von Pathogenen mittels Real Time PCR (Sonden und SYBR-Green)

§ Präparation von DNA aus Lebensmittelproben (Fisch und Gebäck)

§ Identifizierung der Fischart mit RFLP und Vorbereitung zur Sequenzierung

§ Nachweis eines GVO mittels 35S/NOS/FMV real-time PCR mit interner Kontrolle (GMO Screen) für die Versuche