Einleitung

Für quantitative Expressions-Analysen der konstitutiven und induzierten Genregulationen hat sich die reverse Transkription mit anschließender Real Time PCR bewährt (RT-qPCR). In diesem Kurs lernen Sie, wie man eine solche Genexpressionsanalyse etabliert, optimiert und das Troubleshooting durchführt.

Lernziele und Inhalte
Wir gehen den Weg von der RNA-Extraktion mit und ohne Aufreinigung über die cDNA-Synthese und die qualitative und quantitative Kontrolle der cDNA. Schauen uns das sogenannte Gene of Interest an und die endogene Referenz, designen ein Primer- und Sonden-Beispiel und führen im Labor die eigentliche Expressionsstudie durch. Die Daten werden mit verschiedenen Methoden ausgewertet. Am Ende des Kurses werden Sie in der Lage sein eine Expressionsstudie mit dem Fokus auf ein MIQE-konformes Protokoll zu entwickeln, durchzuführen und die Ergebnisse auszuwerten.

Theorie-Teil

§ Aufbau und Struktur von DNA, RNA und Genomen

§ Exon-Intron-Struktur, Primer-Design für eine optimale Multiplex-Sonden-PCR

§ Prinzip der Real Time PCR und unterschiedliche Detektionsformate

§ Grundlagen der Real Time PCR: Ct-Werte, Threshold, Baseline

§ Auswahl und Analyse der geeigneten endogenen Referenz

§ Relative Quantifizierung mit Standard-Kurve und mittels deltaCT

§ Trouble Shooting

Praxis-Teil

§ Präparation von total-RNA, mRNA und deren Quantifizierung

§ Nachweis der RNA-Integrität mittels PCR und Prüfung der Abwesenheit von gDNA (Alu-PCR)

§ Methoden der cDNA-Synthese (Oligo-dT, random und Gen-spezifisches Priming)

§ Bestimmung von Effizienz, Bestimmungswert und Auswahl geeigneter endogener Referenzen

§ Relative Quantifizierung mit den Kursdaten

§ Überprüfung auf MIQE-Konformität