Genexpressionsanalyse mit Real-Time PCR
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Genexpressionsanalyse mit Real-Time PCR
Wann und Wo?
Datum: 15. bis 17. Oktober 2024.
Dauer: 3 Tage - Dienstag bis Donnerstag
Zeit: 9:00 Uhr bis 16:30 Uhr
Ort: Bremen
Einführung
Früher hatten wir im Kurs die Expression von Cytochrom P1B1
in den Mundschleimhautzellen von Rauchern im Vergleich zu Nichtrauchern
analysiert, bis dann unser Kettenraucher als Positiv-Kontrolle nicht
mehr zur Verfügung stand. Jetzt analysieren wir die Expression von Hitzeschock-Genen in Hela-Zellen.
Die RT-qPCR ist ideal für solche Fragestellungen, genauer als ein Microarray, aber deutlich weniger aufwendig als NGS.
Lernziele und Inhalte
Am Ende des Kurses werden Sie in der Lage sein eine Expressionsstudie mit dem Fokus auf ein MIQE-konformes Protokoll zu entwickeln, durchzuführen und die Ergebnisse auszuwerten.
Wir
starten mit einer Wiederholung der Themen PCR, real-time PCR und
schauen uns dann zunächst einmal an welche Methoden es gibt für die
Isolation der RNA/mRNA, der cDNA-Synthese und der Qualitätskontrolle, z.
B. Messung im Photometer, Gelelektrophorese und Integritätstest mit qPCR.
Danach betrachten wir das sogenannte Gene of Interest und diskutieren welche endogene Referenz wir benutzen sollen und warum, wieso, weshalb man bei den alten Klassikern wir ß-Actin und GAPDH vorsichtig sein soll. Wir suchen nach Kits und designen aber auch selbst Primer und Sonden für unsere Aufgabe.
Für die eigentliche Expressionsstudie arbeiten wir mit einem Sonden-Multiplex-PCR: Mittels Standard-Kurve überprüfen wir zunächst unsere real-time PCRs, bestimmen die Effizienz und den Bestimmtheitsmaß (R2) der PCR, danach werten wir mit verschiedenen Methoden aus, Standard-Kurve und DeltaDeltaCT mit und ohne Effizienzkorrektur.
Im Vergleich dazu schauen wir uns Daten mit SYBR-Green an,
TeilnehmerInnen, die mit SYBR-Green arbeiten wollen, können das auch
gerne machen.
Zugegeben ein dichtes und anspruchsvolles
Programm, ich bin aber sicher wir schaffen das. Nach dem Kurs können wir
immer noch das ein oder andere Nacharbeiten.
Zielgruppe
Technische
oder wissenschaftliche MitarbeiterInnen. Sie haben PCR/qPCR-Erfahrung
und arbeiten oder planen an einer Expressionstudie zu arbeiten.
Gut zu wissen:
Sie
benötigen Grund-Kenntnisse in real-time PCR. Grundkenntnisse bzgl.
DNA/RNA und klassischer PCR sind von Vorteil, können aber auch auf
unserer Lernplattform wiederholt werden. Die Zugangsdaten für den
Vorkurs erhalten Sie nach der Kurs-Anmeldung.
Wenn Sie unsicher sind, ob der Kurs das Richtige für Sie ist fragen sie uns.
Wir arbeiten mit unserem eigenen real-time Cycler der neuesten Generation von BMS und einem zweiten Leihgerät mit Unterstützung von BIOZYM.
Wir arbeiten mit FAST-PCR-Reagenzien, was es uns erlaubt ein Experiment in ca.: einer Stunde durchzuführen, um zeitnah die Ergebnisse mit ihnen zu diskutieren.
Einzelne Begriffe hab ich Ihnen verlinkt auf unsere Wissensdatenbank.
"Nur wer sein Ziel kennt, findet den Weg. (Laotse)"
Praxisteil I (RNA-Präparation cDNA-Synthese)
- Isolation von RNA aus Hela-Zellen mit und ohne Hitzeschock-Behandlung
- Nucleinsäure Messung im Photometer, Gelelektrophorese
- Nachweis der Integrität und frei von gDNA mittels qPCR
Praxisteil II
- Auswertung der Ergebnisse des 1. Tages
- cDNA-Standard Kurve und Multiplex-RT-qPCR
- Bestimung der Effizienz und R2-Wertes
- Effizienzvergleich der endogenen Referenzen und der Gene of Interests
Praxisteil III
- Relative Quantifizierung: Auswertung mit Standard-Kurve, DeltaDelta Ct mit und ohne Effizienzkorrektur
- Troubleshooting
Theorieteil
Die Theorie wird begleitend zu den Experimenten besprochen.
- Aufbau und Struktur von Genen, Exon-Intron-Struktur, Genomen Pseudogen-Problematik
- Primer-Design für eine optimale Multiplex-Sonden-PCR mit FASTPCR6.8 oder Primer3plus
- Prinzip der Real Time PCR und unterschiedliche Detektionsformate
- Grundlagen der Real Time PCR: Ct-Werte, Threshold-Setting, Baseline-Setting
- Auswahl und Analyse der geeigneten endogenen Referenz
- Relative Quantifizierung mit Standard-Kurve und mittels deltaCT
- Präparation von total-RNA, mRNA und deren Quantifizierung
- Nachweis der RNA-Integrität mittels PCR und Prüfung der Abwesenheit von gDNA (Alu-PCR)
- Methoden der cDNA-Synthese (Oligo-dT, random und Gen-spezifisches Priming)
- Bestimmung von Effizienz, Bestimmungswert und Auswahl geeigneter endogener Referenzen
- Relative Quantifizierung mit den Kursdaten
- Überprüfung auf MIQE-Konformität
Lernplattform
Eine
Lernplattform (Moodle, e-learning4science.com) hält für Sie das Script
als PDF, Versuchsbeschreibungen und Literatur-Links-Downloads bereit.
Nachbesprechung
Zusätzlich biete ich eine gemeinsame Online-Fragestunde für Troubleshooting oder weitergehende Fragen an. Die Fragestunde wird mit GoTo-Meeting durchgeführt.