Real-Time PCR Basiskurs

Wann und Wo?

Datum: 09. bis 11. April 2024

Dauer: 3 Tage - Dienstag bis Donnerstag

Zeit: 9:00 Uhr bis 16:30 Uhr

Ort: Bremen

Einführung

Lernziele

Zielgruppe

Gut zu wissen:

• Sie benötigen keine Kenntnisse in real-time PCR, Grundkenntnisse bzgl. DNA/RNA und klassischer PCR sind von Vorteil, können aber auch auf unserer Lernplattform wiederholt werden. Die Zugangsdaten für den Vorkurs erhalten Sie nach der Kurs-Anmeldung.
• Wenn Sie unsicher sind, ob der Kurs das Richtige für Sie ist fragen sie uns.
• Wir arbeiten mit unserem eigenen real-time Cycler der neuesten Generation von BMS und einem zweiten Leihgerät mit Unterstützung von Biozym.
• Wir arbeiten mit FAST-PCR-Reagenzien, was es uns erlaubt ein Experiment in ca.: einer Stunde durchzuführen, um zeitnah die Ergebnisse mit ihnen zu diskutieren.
• Einzelne Begriffe hab ich Ihnen verlinkt auf unsere Wissensdatenbank.

"Was du mir sagst, das vergesse ich. Was du mir zeigst, daran erinnere ich mich. Was du mich tun lässt, das verstehe ich." (Konfuzius).

Praxisteil I (qPCR, Nachweis)

• Ich kann pipettieren oder tropft bei Ihnen auch immer das Chloroform aus der Spitze ? Ein kleiner Exkurs über richtiges Pipettieren ist immer hilfreich.
• Nachweis von Legionellen DNA: Arbeiten mit Sequenz-unspezifischer Detektion, Standard-Verdünnungskurve und Schmelzkurve
• Interpretation einer SYBR/Eva-Green Schmelzkurve, Unterscheidung von Dimerenund Hauptprodukt, Was tun bei Dimeren?
• Bestimmung der Effizienz und des R2-Wertes aus der Standardkurve, Welche Grenzwerte muss mein qPCR einhalten? Bestimmung der Nachweisgrenze (LoD) und Quantifizierungsgrenze (LoQ).

Praxisteil II (Genotypisierung, Sexing)

• Unter Sexing versteht man die Bestimmung des Geschlechts eines Lebewesens, hier mittels molekularbiologischen Methoden wie PCR an DNA.
• Eva-Green real-time PCR und Amelogenin-Typisierung mittels High Resolution Melt (HRM): Auswertung einer HRM-Analyse, PCR-Ansatz ohne DNA-Präparation (direkt-PCR), Diskussion der Inhibition, Differenzen-Analyse und automatische Typisierung u. a. m.
• Sonden-PCR mit X- und Y-spezifischen Taqman-Sonden (TaqMan-Assay): Fluorophor/Reporter und Quencher-Kombinationen, Auswahl der richtigen Detektionskanäle, Pipettierplan mit Primer und Sonden, Optimierung der Primer und Sonden-Konzentration, Ermittlung der Ct-Werte, Auswertung als Endpunktmessung.
• Sonden-Schmelzkurve: Planung, Auswahl der Sonden, Pipettierplan für ein asymmetrisches PCR, Schmelzkurve mit TaqMan-Sonden

Praxisteil III (RT-qPCR)

• Präparation von RNA aus Zellpellets mit und ohne Hitzeschock: OD-Messung im Photometer, Möglichkeiten weiterer Qualitätskontrollen
• cDNA-Synthese mit Random/Oligo-dT-Primern: Diskussion der Vor- und Nachteile, optional cDNA Synthese mit spezifischen Primern, direkt RT-qPCR.
• cDNA-Standard-Kurve: Ermittlung der Effizienzen im Multiplex-PCR (4plex), experimentelle Auswahl der richtigen endogenen Referenz
• Auswertung nach der relativen Quantifizierung: DeltaDeltaCt mit und ohne Effizienkorrektur

Theorieteil

• PCR-Einführung: Auffrischen was Sie wissen: PCR-Grundlagen, Historie, Material und Anwendungen, Fragen und Aufgaben
• real-time PCR-Einführung: Historie von der PCR zur kompetitiven PCR zur ersten real-time PCR, Einführung real-time PCR
• Detektionsprinzip I: Sequenz-unspezifische Detektion, Fluoreszenz, Fluorophor. Die richtige Anregungswellenlänge, Amplifikations-Graph, Schmelzkurve, Rohdaten und prozessierte Daten Basislinie, Threshold, Threshold Setting, Referenzfarbstoff, ROX u. a. m
• Detektionsprinzip II: Detektion Mittels Sonden: TaqMan Hydrolysis-Sonden, FRET-Sonden, Molecular Beacon, double quenched Probes,Scorpion-Sonden u. a.
• Anwendungen und qPCR-Variationen: Nachweis und Typisierung, relative und absolute Quantifizierung Genexpressionsanalyse
• Additive und Basenanaloga: Betain, LNA-Nucleotide, MGB
• RT-QPCR: Planung Two Step PCR, One Step PCR (Beispiel Corona), In-silico-PCR: Exon-Intron Struktur Splice-Varianten, Auswahl der passenden endogenen Referenz Normalisierungsstrategien
• Material und Cycler: Übersicht über real-time Cycler, Mastermixe und Sonden-Farbstoffe, Auswahl und Bestellung, Auswertung: Qualifizierung der RNA, Nachweis der RNA-Integrität, Nachweis frei von gDNA, Bestimmung der Effizienzen, endogene Referenz und Gene of Interest (GOI) Auswertung, Ableitung der Formeln, Relative Quantifizierung über absolute Quantifizierung, über Standardkurve, Delta CT, DeltaDeltaCt mit und ohne Effizienzkorrektur MIQE: Minimum Information of Publication of quantitative Real-Time PCR Experiments

Nachbesprechung

• Zusätzlich biete ich eine gemeinsame Online-Fragestunde für Trouble-Shooting oder weitergehende Fragen an. Die Fragestunde wird mit GoTo-Meeting durchgeführt.

Lernplattform

Eine Lernplattform (Moodle, e-learning4science.com) hält für Sie das Script als PDF, Versuchsbeschreibungen und Literatur-Links-Downloads bereit.