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Genexpressionsanalyse mit Real-Time PCR

Registration for Genexpressionsanalyse mit Real-Time PCR
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Wann und Wo?

Datum: 15. bis 17. Oktober 2024.

Dauer: 3 Tage - Dienstag bis Donnerstag

Zeit: 9:00 Uhr bis 16:30 Uhr

Ort: Bremen


Einführung

Früher hatten wir im Kurs die Expression von Cytochrom P1B1 in den Mundschleimhautzellen von Rauchern im Vergleich zu Nichtrauchern analysiert, bis dann unser Kettenraucher als Positiv-Kontrolle nicht mehr zur Verfügung stand. Jetzt analysieren wir die Expression von Hitzeschock-Genen in Hela-Zellen.
Die RT-qPCR ist ideal für solche Fragestellungen, genauer als ein Microarray, aber deutlich weniger aufwendig als NGS.

Lernziele und Inhalte

Am Ende des Kurses werden Sie in der Lage sein eine Expressionsstudie mit dem Fokus auf ein MIQE-konformes Protokoll zu entwickeln, durchzuführen und die Ergebnisse auszuwerten.
Wir starten mit einer Wiederholung der Themen PCR, real-time PCR und schauen uns dann zunächst einmal an welche Methoden es gibt für die Isolation der RNA/mRNA, der cDNA-Synthese und der Qualitätskontrolle, z. B. Messung im Photometer, Gelelektrophorese und Integritätstest mit qPCR.
Danach betrachten wir das sogenannte Gene of Interest und diskutieren welche endogene Referenz wir benutzen sollen und warum, wieso, weshalb man bei den alten Klassikern wir ß-Actin und GAPDH vorsichtig sein soll. Wir suchen nach Kits und designen aber auch selbst Primer und Sonden für unsere Aufgabe.
Für die eigentliche Expressionsstudie arbeiten wir mit einem Sonden-Multiplex-PCR: Mittels Standard-Kurve überprüfen wir zunächst unsere real-time PCRs, bestimmen die Effizienz und den Bestimmtheitsmaß (R2) der PCR, danach werten wir mit verschiedenen Methoden aus, Standard-Kurve und DeltaDeltaCT mit und ohne Effizienzkorrektur. Im Vergleich dazu schauen wir uns Daten mit SYBR-Green an, TeilnehmerInnen, die mit SYBR-Green arbeiten wollen, können das auch gerne machen.
Zugegeben ein dichtes und anspruchsvolles Programm, ich bin aber sicher wir schaffen das. Nach dem Kurs können wir immer noch das ein oder andere Nacharbeiten.

Zielgruppe

Technische oder wissenschaftliche MitarbeiterInnen. Sie haben PCR/qPCR-Erfahrung und arbeiten oder planen an einer Expressionstudie zu arbeiten.

Gut zu wissen:

Sie benötigen Grund-Kenntnisse in real-time PCR. Grundkenntnisse bzgl. DNA/RNA und klassischer PCR sind von Vorteil, können aber auch auf unserer Lernplattform wiederholt werden. Die Zugangsdaten für den Vorkurs erhalten Sie nach der Kurs-Anmeldung.
Wenn Sie unsicher sind, ob der Kurs das Richtige für Sie ist fragen sie uns.
Wir arbeiten mit unserem eigenen real-time Cycler der neuesten Generation von BMS und einem zweiten Leihgerät mit Unterstützung von BIOZYM.
Wir arbeiten mit FAST-PCR-Reagenzien, was es uns erlaubt ein Experiment in ca.: einer Stunde durchzuführen, um zeitnah die Ergebnisse mit ihnen zu diskutieren.
Einzelne Begriffe hab ich Ihnen verlinkt auf unsere Wissensdatenbank.

"Nur wer sein Ziel kennt, findet den Weg. (Laotse)"


Praxisteil I (RNA-Präparation cDNA-Synthese)

  • Isolation von RNA aus Hela-Zellen mit und ohne Hitzeschock-Behandlung
  • Nucleinsäure Messung im Photometer, Gelelektrophorese
  • Nachweis der Integrität und frei von gDNA mittels qPCR

Praxisteil II

  • Auswertung der Ergebnisse des 1. Tages
  • cDNA-Standard Kurve und Multiplex-RT-qPCR
  • Bestimung der Effizienz und R2-Wertes
  • Effizienzvergleich der endogenen Referenzen und der Gene of Interests

Praxisteil III

  • Relative Quantifizierung: Auswertung mit Standard-Kurve, DeltaDelta Ct mit und ohne Effizienzkorrektur
  • Troubleshooting

Theorieteil

Die Theorie wird begleitend zu den Experimenten besprochen.
  • Aufbau und Struktur von Genen, Exon-Intron-Struktur, Genomen Pseudogen-Problematik
  • Primer-Design für eine optimale Multiplex-Sonden-PCR mit FASTPCR6.8 oder Primer3plus
  • Prinzip der Real Time PCR und unterschiedliche Detektionsformate
  • Grundlagen der Real Time PCR: Ct-Werte, Threshold-Setting, Baseline-Setting
  • Auswahl und Analyse der geeigneten endogenen Referenz
  • Relative Quantifizierung mit Standard-Kurve und mittels deltaCT
  • Präparation von total-RNA, mRNA und deren Quantifizierung
  • Nachweis der RNA-Integrität mittels PCR und Prüfung der Abwesenheit von gDNA (Alu-PCR)
  • Methoden der cDNA-Synthese (Oligo-dT, random und Gen-spezifisches Priming)
  • Bestimmung von Effizienz, Bestimmungswert und Auswahl geeigneter endogener Referenzen
  • Relative Quantifizierung mit den Kursdaten
  • Überprüfung auf MIQE-Konformität

Lernplattform

Eine Lernplattform (Moodle, e-learning4science.com) hält für Sie das Script als PDF, Versuchsbeschreibungen und Literatur-Links-Downloads bereit.

Nachbesprechung

Zusätzlich biete ich eine gemeinsame Online-Fragestunde für Troubleshooting oder weitergehende Fragen an. Die Fragestunde wird mit GoTo-Meeting durchgeführt.

Date & Time
Tuesday
October 15, 2024
Start - 9:00 AM
Thursday
October 17, 2024
End - 4:00 PM Europe/Berlin
Location

OMNI Life Science GmbH & Co KG

Karl-Ferdinand-Braun-Straße 2
28359 Bremen
Germany
+49 421 2761690
orders@ols-bio.de
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Organizer

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